乾燥および再湿潤イベント中の微生物構造およびメタン生成に対する酸素の影響の欠如

Scientific Reports volume 12、記事番号: 16570 (2022) この記事を引用

964 アクセス

5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

排水が頻繁に起こる自然環境では、乾燥と再湿が起こり、水の利用可能性と酸素への曝露が変動します。これらの比較的劇的なサイクルは、環境中の微生物の活動とその後のメタンと二酸化炭素の排出に大きな影響を与えます。この研究では、異なる系統構造を持つ厳密な嫌気性環境（嫌気性消化槽）からメタン生成群集を、好気（空気）および嫌気（窒素）条件下での連続した乾燥イベントに投入し、その後再湿潤させることにより、乾燥および再湿潤イベントを模倣しました。我々は、各再湿潤後にメタン生成が迅速に回復することを示しましたが、驚くべきことに、好気性乾燥イベントと嫌気性乾燥イベントの効果の間に有意差は観察されませんでした。乾燥と再湿潤を連続的に行った後、微生物群集の構造にわずかな変化が見られ、メタン生成速度が低下しました。これは、利用可能な有機物のプールの枯渇またはメタン生成群集の阻害に起因すると考えられます。これらの観察は、乾燥と再湿潤のイベントまたは酸素曝露と比較して、初期の系統発生構造と有機物の量と質がメタン生成群集と全体的な微生物群集の反応に対してより強い影響を示したことを示しています。これらの結果は、酸素曝露に対する厳密な嫌気性微生物の感受性に関する現在のパラダイムを変えるものである。

頻繁に排水が行われる自然環境では、地下水面の急激な変化によって酸素 (O2) 曝露量が変動する乾燥と再湿潤現象が発生します。厳密な嫌気性菌は一般に O2 に対する耐性が低いと考えられていますが、休止期を形成したり、活性酸素種 (ROS) を不活化する酵素を生成したりするなど、O2 曝露に対処するためにさまざまな戦略を適用することができます1。さらに、メタン生成菌は、O2 感受性微生物であると考えられていますが、乾燥によって促進される O2 曝露に対する回復能力があることが示されています。メタン生成菌は、頻繁に空気が排出される水田の酸素欠乏土壌などの酸化環境でよく発見されており、カタラーゼ (KAT) 遺伝子などの抗酸化遺伝子もそのゲノム、特にクラス II メタン生成菌のゲノムで検出されています。、Methanosarcina barkeri、Methanobrevibacter arbariphilus、および Methanocellales も耐気性を示しています 2,3。さらに、クラス I メタン生成菌 (例、メタノピラ目、メタノバクテリア目、メタノコッカス目) と比較して、メタノセラ目、メタノ微生物目、およびメタノサルシナレス目では、酸化ストレスに対する高い耐性が報告されています 2。この耐性は、O2 および反応性によって引き起こされる損傷に対抗する能力に起因する可能性があります。より多様でより高い発現レベルの抗酸化酵素や、新しい O2/ROS 除去経路の開発など、強化された防御/修復機構を介して酸素種 (ROS) を除去します。微生物学は修正されるべきである。すなわち、厳密な嫌気性メタン生成菌の一部の分類群が酸素条件下でも生存できるようにすべきである4。さらに、淡水堆積物の乾燥とそれに続く再湿潤後の有機物の分解とメタン生成の促進によって証明されるように、その機能は急速に回復することが示されています5。どのような環境要因がこの回復に寄与しているのかは不明であるが、乾燥と再湿潤後の堆積微生物群集の変化が報告されており、これは異なる起源の堆積物では明らかであった。この観察は、空気乾燥と再湿潤が有機物の特性に影響を与える可能性があるため、乾燥に対する微生物の反応に対するさまざまな有機源の潜在的な影響に関する仮説につながりました 4。同様に、有機物の可溶化の増加と土壌凝集体の破壊により、土壌の乾燥と再湿潤により有機物の無機化が促進されることが観察されています8。対照的に、ヘルナンデスら。 (2019) は、乾燥と再湿潤の効果と比較して、微生物群集に対する土壌有機物の影響は軽微であることを観察しました9。 Conrad (2020) は、乾燥と O2 曝露に対するメタン生成の非感受性がこれらの対照的な結果のもっともらしい説明である可能性があると提案し、嫌気性微生物群集の酸化剤耐性は、季節的/周期的に乾燥および再湿潤する本来の生態環境によって獲得または強化される可能性があると仮説を立てました4 。

しかし、嫌気性微生物群集の酸化剤耐性がどのように発達するかを理解することは、自然の生態環境を研究することによって制限される可能性があります。なぜなら、これらの考えられる酸化剤耐性メカニズムはそのような環境ではすでに確立されているはずだからです。したがって、頻繁に排水される自然環境には、O2 耐性および/または乾燥耐性のある微生物がより多く含まれるはずであると考えるのが合理的です4。一方、好気的状況がほとんどない環境で生育する嫌気性群集は、空気乾燥と再湿潤によって悪影響を受けるはずです。嫌気性消化槽（AD）は、嫌気性環境を比較的長期間維持し、有機物の分解とメタン生成を最大化するために有機物を継続的に利用できるように設計されたシステムです10。アルツハイマー病の微生物群集は定期的な酸素（または水分喪失）にさらされないため、酸化ストレスや乾燥に対処するように適応するとは考えられません。したがって、アルツハイマー病による乾燥と高酸素曝露の微生物群集の経験は、少なくとも現在確立されている知識によれば、メタン生産の再開の困難さによって示されるように、微生物群集の構造と機能的損傷の劇的な変化を促進するはずである。我々の結果は、厳密な嫌気性微生物に対するO2/オキシダントの重篤な毒性に関する上記の理解に疑問を投げかけ、いくつかのO2耐性メタン生成菌と、未調査の嫌気性微生物耐性のメカニズムを明らかにした。

(a) ヘンリックスダール廃水処理施設 (WWTP) (ストックホルム、スウェーデン)、(b) 食品廃棄物を含むオービィバイオガスプラント (スウェーデン、リンシェーピング)、および (c) 農業廃棄物を含むガスムヨルドベルガ (スウェーデン、リンシェーピング) からの嫌気性消化汚泥2017 年 10 月にサンプリングされ、研究室に輸送され、室温 (約 25 °C) で数時間保管されました。次に、スラッジを培地と接種源の両方として使用して、乾燥 (空気および N2 下) と再湿潤がメタン生産の回収に及ぼす影響を調査しました。３つの汚泥に対して乾燥および再湿潤処理を行わなかった対照群が含まれた。汚泥および処理の種類ごとにバッチボトルを 3 つずつセットしました。

この研究では、メタン生成はメタン生成機能の間接的な尺度であるため、研究対象の系では微生物の機能としても解釈されました。ただし、メタン生成という用語は、明確にするため、また誤解を避けるために選択されました。 1 回の乾燥および再湿潤イベント (サイクル 1) 後のメタン生成パフォーマンスは、自動メタン電位試験システム II (AMPTS II、Bioprocess Control、スウェーデン) を使用して評価されました。 N2 でフラッシュしながら、400 mL のスラッジを各バッチボトルに加え、250 mL のヘッドスペースを残しました。次に、すべてのバッチボトルをサーモスタット水浴 (37 °C) に置き、AMPTS II システムに接続しました。ミキサーは、２０分間の混合と５分間の休止のサイクルで撹拌するように設定された。生成されたメタンの量は、ソフトウェアによって標準の温度と圧力に自動的に変換されました。空気乾燥および N2 乾燥では、汚泥の種類および処理ごとに 2 つのトレイを使用しました。各トレイには 1.2 L の汚泥が供給され、蓋で閉められ、N2 または空気の入力ホースと順応部屋 (37 °C) の換気システム用の出力ホースに接続されました。ホースはサンプルの内部に配置されているため、乾燥中に空気/N2 が消化物に深く浸透する可能性があります。乾燥プロセスは、汚泥サンプルが完全に乾燥するまで（水分損失による TS 重量の減少によって評価）、空気乾燥処理と N2 乾燥処理でそれぞれ約 14 日間と 20 日間続きました。乾燥後、すべてのバッチボトルに一定量の乾燥スラッジを充填し、O2 フリーの Milli-Q 水で再度湿らせてスラッジの量を 400 mL にし、N2 でフラッシュして嫌気条件を確保し、AMPTS II に接続しました。前述したとおりです。並行して、バッチボトルの 1 つのトレイ (三重) は、N2 または空気乾燥処理を対照グループとして設定したことを除き、同じ設定を行いました。その後の繰り返しの乾燥-再湿潤およびインキュベーション操作を容易にするために、サイクル 2 および 3 は、従来のバッチシステムでサイクル 1 で説明したのと同様の乾燥および再湿潤プロセスで実行されました。バッチボトルの設定とメタン含有量の計算は、各 320 mL ボトルに 160 mL のスラッジを加えた点を除き、Sun et al.11 によって以前に説明されています。乾燥処理ごとに、ボトルを開け、37 °C のインキュベーションルームで空気または N2 を流しました。サイクル 2 および 3 では、汚泥サンプルは 5 ～ 7 日間のガスフラッシュで完全に乾燥しました。 3 つのサイクルすべてにおいて、乾燥プロセス中に撹拌は行われませんでした。サイクル 1 と同様に、汚泥サンプルを O2 フリーの Milli-Q 水で再度湿らせ、37 °C で再インキュベートしました。 N2 または空気乾燥処理を行わないバッチボトルの 1 つのトレイ (3 つ組) を対照グループとして並行してセットアップしました。対照グループで生成されたガスは、各サイクルの間にボトル圧力をリセットするために放出されました。各乾燥再湿潤およびインキュベーションイベント後の各バッチボトルおよび元の接種材料から約 2 mL のスラッジをサンプリングし、これらのサンプルは後の分子分析のために -20 °C に維持されました。

サイクル 1 では、水の置換に基づいて動作するガスメーターを使用して、総バイオガス生産量を決定しました。サイクル 2 および 3 では、バイオガス生成量を定量化するために、各ボトル内のガス圧力を圧力計 (Testo 312、ドイツ) で定期的に測定しました。ガスクロマトグラフィー (5880A シリーズ、Hewlett Packard、米国) によるヘッドスペースのメタン含有量分析のためにガスサンプルを収集しました。メタン生成は、各ボトルのスラッジ含有量（つまり、標準的な ml g-1 消化物）に対して標準化し、標準大気圧および 0 °C で報告しました。各処理の前後に、汚泥サンプルのいくつかのパラメータが測定されました。サンプルを 0.45 μm ポリエーテルスルホン膜 (米国) で濾過した後、溶解有機炭素 (DOC) を TOC 分析装置 (島津 TOC-VCPH、日本) で分析しました。酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、イソ酪酸塩、吉草酸塩、イソ吉草酸塩などの VFA 濃度は、Jonsson と Borén に従ってガスクロマトグラフ (6890 シリーズ、Hewlett Packard、米国) を使用して分析されました12。ｐＨは、ｐＨ電極（ＩｎｆｏＬａｂｐＨ７３１０、ドイツ）を使用して測定した。スチューデントの t 検定とウェルチの ANOVA を R ソフトウェア (バージョン 4.0.2) で実行し、サンプル間のメタン生成量と速度の違いを分析しました。

保存した各サンプルの 3 連の 200 mg のアリコートを使用して、以前に説明したように、土壌用 FastDNA スピンキット (MP Biomedicals、カリフォルニア州サンタアナ、米国) を使用して全ゲノム DNA を抽出しました。 DNA 濃度は、Qubit 3.0 蛍光光度計 (Invitrogen、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) によって定量されました。 16S rRNA 遺伝子配列ライブラリーは、細菌群集のプライマーペア 515'F(GTGBCAGCMGCC GCG GTAA)/805R(GAC TAC HVGGG TAT CTA ATC C) および 516F(TGY CAG CCG CCG CGG) を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) によって調製しました。古細菌コミュニティ用の TAA HACCVGC)/915R(GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT)13,14。詳細な PCR 手順と配列ライブラリーの調製手順は以前に説明しました 15。次世代アンプリコン配列決定は、スウェーデン、ウプサラにある SciLifeLab の SNP&SEQ テクノロジープラットフォームで Illumina MiSeq テクノロジーを使用して実行されました。生データは、R ソフトウェア (バージョン 4.0.2) のオープンソースバイオインフォマティクスパイプライン DADA2 (バージョン 1.16) を通じて分析されました16。順方向配列と逆方向配列は、品質閾値が maxEE = 2 および truncQ = 2 である細菌の場合はそれぞれ 259 および 150 bp の長さに切断され、maxEE = 2 および truncQ = 2 である古細菌の場合は 280 および 240 bp に切断されました。 FIGARO17によるシリコ計算。分類学的プロファイルは、rRNA データベース SILVA、リリース 13218 を使用して、アンプリコン配列バリアント (ASV) に基づいて割り当てられました。

ソフトウェア STAMP (バージョン 2.1.3)19 を使用して、サンプル間の属レベルでの相対存在量の違いを分析するための ANOVA テストと事後テストを実行しました。非計量多次元尺度法 (NMDS) を適用して、サンプル間の微生物群集の非類似性を評価しました (R のビーガンパッケージ、順列 = 999)。細菌群集の多様性は、R パッケージ「hillR」(https://CRAN.R-project.org/package=hillR) の Hill 多様性指数 0D および 1D20 を使用して評価されました。相対存在量が全配列閾値の 0.1% 以上である細菌と古細菌の組み合わせ ASV テーブルを使用して、共起ネットワーク分析 (R の RCy3 および igraph パッケージ) を実施しました。 ASV の各ペア間でスピアマンの順位相関が計算され、多重比較時の誤検出率を制御するためにベンジャミニ・ホッホバーグ補正によって p 値が補正されました 21。共起ネットワークには、有意性 p ≤ 0.001 および係数 ≥ 0.5 の相関が存在しました。共起ネットワーク構造と潜在的なキーストーン微生物を評価するために、次数、中間性、近さ中心性指数が計算されました22。共起ネットワーク図は、Cytoscape (バージョン 3.7.2) を使用してプロットされました。

乾燥によって引き起こされるメタン生成生成と微生物群集の変化を O2 曝露の影響と区別するために、嫌気性汚泥を空気および N2 雰囲気下で乾燥し、O2 を含まない水で 3 回連続して再湿らせました。汚泥サンプルは、下水汚泥、農業廃棄物、食品廃棄物消化装置という 3 つの異なるカテゴリーの AD から採取されました。これらは、明らかに異なる系統構造を持つメタン生成コミュニティを有する可能性があることが知られています 23,24。乾燥と再湿潤のイベントの後、メタン生成生成とコミュニティ構造が評価されました。予想通り、メタン生成率は時間の経過と各乾燥/再湿潤イベント後に減少し、農業廃棄物からのメタン生成率が高く、次いで食品廃棄物と下水汚泥からのメタン生成率が続きました(表 1)。しかし、全体的な傾向はすべての実験で一定であり、3 つの乾燥-再湿潤イベントすべてで再湿潤後のメタン生成生成の迅速な回復が見られ、空気による乾燥と N2 による乾燥の間には全体的に明らかな違いがありませんでした (表 1)。

最初の乾燥-再湿潤イベントは 3 種類の汚泥のメタン生成にマイナスの影響を及ぼしましたが、次の 2 つの乾燥-再湿イベントは一般に、対照群と比較してメタン生成量と速度に有意なプラスの効果をもたらしました (表1)。最後の処理後の食品廃棄物および下水汚泥サンプルでは、おそらく有機物の枯渇により、メタン生成パフォーマンスは両方の処理 (空気および N2 乾燥) で同様になりました。「枯渇した」汚泥（1 回の乾燥後）は、未乾燥の対照よりも多くのメタンを生成し、乾燥によって有機物の利用可能性が高まり、メタン生成が促進される可能性があることを示唆しています（表 1）。この結果は、有機物の利用可能性と組成に関するこれまでのいくつかの研究の結果と一致しています。これには、サンプルの空気乾燥とその後の再湿潤および湿式ふるい分けなど、さまざまな分別手順の評価が含まれます。土壌サンプルの再湿潤は有機物 (OM) の特性に影響を与え7、OM の可溶化を増加させて土壌凝集体を破壊し8、これにより微生物が利用できる OM が増加する可能性があります。メタン生成に関する同様の結果も報告されている。すなわち、アマゾンの三日月湖堆積物 5 およびタイの天水水田土壌 25 における乾燥再湿潤後のメタン生成の増加である。

メタン生成の回復時間は、3 つの異なる材料間、および 1 回目、2 回目、および 3 回目の乾燥再湿潤事象間で異なり (Welch の ANOVA、p < 0.01)、観察されたメタン生成の異なる遅滞期が、メタン生成の起源に関連していることを示しています。微生物群集と有機物の利用可能性。同様の違いは、メタン生成菌の代謝段階と O25 以外の電子受容体の存在に応じて、異なる遅延時間を有する天然の堆積物でも報告されています。しかし、本研究では、空気処理と N2 処理の間の驚くほど類似した反応 (下水汚泥を除く。下水汚泥は他の 2 種類の汚泥に比べてメタン生成量がはるかに少なく、一貫性のない傾向を示した) であることから、O2 曝露には限界があることが示唆されています。遅滞期およびメタン生成の回復に対する影響 (表 1)。

有機物の可溶化に対する乾燥と再湿潤の影響を評価するために、溶存有機炭素 (DOC) 濃度の変化を評価しました。 DOC レベルは 3 つの嫌気性汚泥サンプル間で異なり、最も高い DOC レベルは農業廃棄物消化槽からのサンプル (2526 ± 99 mg/L) で発生し、次に食品廃棄物 (1862 ± 18 mg/L) および下水汚泥 ( 293 ± 5 mg/L) 消化槽。それにもかかわらず、3 つの異なる汚泥タイプの DOC レベルは、すべての乾燥-再湿潤イベント中に同じ降順で発生しました (つまり、農業廃棄物 > 食品廃棄物 > 下水汚泥) (表 S1)。乾燥により、土壌や水生堆積物サンプルなどの DOC の品質と物理化学的特性が大幅に変化する可能性があることはよく知られています 26,27 が、嫌気性汚泥に対する乾燥の影響に関する情報はいくつかの研究に限られており 28,29,30 、情報はありません。微生物の観点からDOCに対する乾燥効果を評価する研究。それにもかかわらず、Knoop et al. (2018) は、都市有機廃棄物を処理する嫌気性消化槽で乾燥中に DOC が減少することを観察しました。彼らの結果は、DOC レベルと溶存 Mg、Ca、Ni、Zn の間に有意な正の相関関係があることも示しました29。

Mg、Zn、Ni の濃度は微生物の酵素活性に影響を及ぼします 31。一方、Ca は微生物の膜透過性の調節に関与します 32。したがって、これらの要素へのアクセスが低下すると、乾燥に対する微生物の耐性が低下する可能性があります。予想通り、N2 や空気乾燥とは無関係に、すべてのスラッジタイプにわたって乾燥および再湿潤イベント後に DOC が減少することが観察されました。この減少に対するもっともらしい仮説は、土壌サンプルで観察されたように、乾燥により難溶性成分の凝集により微細孔が安定化し、凝集体が強化され、その結果 DOC が減少するというものです 33,34。さらに、乾燥によって粒子の疎水性も変化する可能性があり、土壌の疎水性の増加により、その後の再湿潤時の水ポテンシャルの増加が遅くなり、有機物の再溶解能力が低下する可能性があります27,35,36。

実験前の 3 種類の汚泥 (1_AW_I、1_FW_I、および 1_SS_I) の古細菌群集構造は、基質源が異なるため予想どおり異なっていました (図 1)。農業廃棄物および下水汚泥消化槽からの古細菌群集は、偏性アセト乳酸属メタノサエタが大半を占め（それぞれ古細菌群集の 43 および 48%）、一方、食品汚泥消化槽からの古細菌群集ではメタノククレウスの相対的存在量が最も高かった（古細菌群集の 66.5%）。群集）、次にメタノサルシナ（古細菌群集の 24.0%）が続きます（図 1）。メタノサエタ科は酢酸塩のみを使用でき、メタノクレス属はメタン生産に H2 とギ酸塩を使用できますが、メタノサルシナはその基質範囲において非常に多用途ですが、メタン生産にギ酸塩を使用できません 37,38。最初の乾燥再湿潤現象は、農業 AD からの汚泥中のメタノサルシナに関連したメタノバクテリウムの濃縮を促進しました。しかし、2回目と3回目の乾燥再湿潤イベントの後、メタノサルシナの相対的な存在量は大幅に回復し、メタノバクテリウムとメタノサエタに取って代わりました（図S1）。このイベントでは、未分類のバティアーキア古細菌も優勢になりました。古細菌属の中で、メタノサルシナは、乾燥と再湿潤イベントの後でも、農業および食品廃棄物の消化装置からのすべてのサンプルにわたって比較的高い相対存在量を示しましたが、メタノバクテリウムの相対存在量は大幅に減少しました。下水汚泥消化槽からの古細菌群集では、乾燥・再湿潤現象の後、メタノバクテリウムが優勢となり、次にメタノサルシナが続いた（図１）。全体として、異なる起源を持つ古細菌群集はそれぞれ異なる発展を遂げましたが、乾燥と再湿潤現象は他のメタン生成菌と比較してメタノサルシナの確立に有利に働きました。興味深いことに、メタン生成菌群集の組成に関しては、空気処理と N2 乾燥処理の間で明確な違いは見られませんでした。

乾燥・再湿潤（サンプル名は「I」で終わる）および孵化イベント（サンプル名は「I」で終わる）後に分離された 3 種類の汚泥（AW 農業廃棄物、FW 食品廃棄物、および SS 下水汚泥）の属レベルでの古細菌群集の相対存在量「F」で終わります）。各図の左から右に、1 回目、2 回目、3 回目の乾燥再湿潤およびインキュベーションイベントに対応するブロック (サンプル名はそれぞれ 1、2、3 で始まります)。属名を配列に割り当てることができない場合は、最も近い分類分類レベル、つまりクラス (C)、目 (O)、科 (F) が示されています。

私たちの研究で最も予期せぬ発見は、乾燥および再湿潤処理中の O2 曝露が、3 種類の汚泥による後の嫌気培養ステップでのメタン生成にほとんど影響を及ぼさなかったことであり、これは、スラッジによる乾燥後のメタン生成の量と速度が同様であることからもわかります。空気またはN2。最初の再湿潤イベントにおける食品廃棄物と 3 回目の再湿イベントにおける下水汚泥からの風乾古細菌群集によるメタン生成の回収のわずかに長い遅滞期は、実験全体の例外でしたが、他の実験では同様の遅滞期が観察されました。治療条件（表 1）。これらの結果を総合すると、メタン生成菌の O2 感受性についての現在の理解に疑問が生じます。さらに、空気乾燥した嫌気性汚泥と窒素乾燥した嫌気性汚泥との間に予想される古細菌群集の構造に明確な区別が存在しないことは、厳しい嫌気性環境に生息するメタン生成群集であっても酸素耐性能力が生来備わっていることを示唆している。この研究では、メタノサルシナのメンバーに代表されるメタン生成菌のいくつかのグループが、古細菌群集の他のメタン生成菌よりも高いストレス耐性を示しました（図1）。アルツハイマー病では、他のメタン生成菌と比較して、メタノサルシナは、低 pH、高アンモニアおよび塩分含有量などのさまざまな消化槽の操作条件に対する高い適応性により、優勢なメタン生成菌として特定されることがよくあります 39。メタノサルシナの優勢は、自然生態系でも発生します。たとえば、周期的に雨季と乾季を経験するアマゾンの三日月湖の堆積物や、乾燥と酸素条件を経験する乾燥地域の生物学的土壌地殻などです。最近の研究では、ゲノム配列に基づく酸化剤耐性に関して、メタノサルシナを他の 40 のメタン生成菌の中でクラス II に分類しました。さらに、この研究は、この高い酸化物質耐性は、クラス I メタン生成菌と比較して、より多様でより高い抗酸化酵素の発現レベルと、新しい O2/ROS 除去経路の発達に起因する可能性があることを示しました2。 Methanosarcina は基質の利用も柔軟であり、Methanosaeta41 よりも速く成長するため、ストレス条件下での高い耐性に貢献します。さらに、メタノサルシナの高いストレス耐性は、純粋培養としてではなく群落に生息するとさらに強化される可能性があります42,43。しかし、Methanoculleus が乾燥土壌と酸化土壌でも優勢であることが示されていることを考慮すると、乾燥事象は食品廃棄物汚泥中の Methanoculleus (クラス II) の減少を説明しませんでした 40。乾燥および再湿潤イベント後の有機物の特性の変化が、H2 またはギ酸塩と比較して酢酸塩の利用可能性の増加につながる可能性のある説明です。このシナリオでは、農業および食品廃棄物の汚泥中でギ酸塩および水素栄養性のメタノククレウスの代わりにアセト乳酸性のメタノサルシナが復活することが好都合であったであろう。下水汚泥中の有機物のレベルが比較的低かったため、この影響は限定的であった可能性があります。

3 種類の汚泥の細菌群集構造は比較的類似した組成を持っていましたが、相対存在量は異なりました (図 2a および b)。ファーミクテス門は、農業廃棄物消化装置と食品廃棄物消化装置からの総細菌のそれぞれ 52 ％と 48％を占め、次にバクテロイデス門（細菌のそれぞれ 25 ％と 14％）でした。クロアキモネテス門、クロロフレクシ門、アトリバクテリア門、およびサーモトガエ門も、農業廃棄物消化装置および食品廃棄物消化装置で優勢でしたが、農業廃棄物消化装置よりも食品廃棄物消化装置の方がサーモトガエの相対存在量が高い (16%) など、いくつかの違いがありました。農業廃棄物消化槽における相乗効果のある成分の存在。下水汚泥消化槽からの細菌群集は、プロテオバクテリア門 (25%)、バクテロイデテス門 (22%)、クロロフレキシ門 (21%)、およびファーミクテス門 (19%) によって占められていました。放線菌（6%）、アシドバクテリア（3%）、アエギリバクテリア（2%）、スピロヘータ（2%）も低濃度で存在していましたが、農業廃棄物や食品廃棄物の消化装置からのサンプルには存在していませんでした（図2b）。

3種類の汚泥（AW：農業廃棄物、FW：食品廃棄物、SS：下水汚泥）の細菌群集構造。 (a) ASV 読み取り数に基づく非計量多次元尺度法 (NMDS) 分析。汚泥の種類ごとに色分けされた細菌コミュニティの分布を表示します。 (b) 乾燥-再湿潤(サンプル名は「I」で終わる)およびインキュベーションイベント(サンプル名は「F」で終わる)後に分離された3種類の汚泥の門レベルでの細菌群集の相対存在量。棒グラフは上から下に、農業廃棄物、食品廃棄物、下水汚泥に対応します。棒グラフは左から右に、1 回目、2 回目、3 回目の乾燥再湿潤およびインキュベーションイベントに対応します (サンプル名はそれぞれ 1、2、3 で始まります)。少なくとも 1 つのサンプルで相対存在量が 1.0% 以上の細菌が示されています。

最初の乾燥と再湿潤現象は 3 つの細菌群集の構造を変化させ、農業におけるプロテオバクテリアの相対存在量が 1 未満から 53% (空気乾燥) および 68% (N2 乾燥) へと 1 桁大幅に増加しました。廃棄汚泥。食品廃棄物スラッジの場合は 4% から最大 34% (空気乾燥)、および 13% (N2 乾燥)。下水汚泥の場合は 25% から最大 46% (空気乾燥) および 37% (N2 乾燥) になります (図 2b)。しかし、最初の培養イベントの後、プロテオバクテリアの相対的な存在量は減少し(< 10%)、特に農業および食品廃棄物の消化物サンプルにおいてファーミクテス属が細菌群集を支配しました。同じパターン、つまり、乾燥-再湿潤および培養イベント中にプロテオバクテリアとファーミクテスが交互に優勢になるというパターンが、2回目と3回目の処理でも繰り返され、最終的には他のバクテリアのほとんどを打ち負かしました[個体数の減少としても示されています]。多様性指数（表S2）]。属レベルでは、このプロセスは、ファーミクテス門内のハイドロゲニスポラとアルカリフィルスの相対存在量の統一的な増加として発生しました（図S2）。一方、プロテオバクテリアの場合、相対存在量の増加は微生物群集の起源に応じて多少異なりました。農業廃棄物および食品廃棄物のサンプルでは Pusillimonas 属に代表され、下水汚泥サンプルでは Burkholderiaceae 科の未分類のメンバーに代表されます（図 S3）。さらに、同じくプロテオバクテリア門に属するハロバクテロイド科が、食品廃棄物および下水汚泥サンプルにおいて実験終了時に増加した。 Hydrogenisspora 属はさまざまな糖を発酵させて水素と酢酸を生成することができますが、Alkaliphilus は糖を発酵させて酢酸とギ酸を生成することができます 44,45。ブルクホルデリア科およびハロバクテロイド科のメンバーもさまざまな糖を発酵することが示されており 46,47、一方、プシリモナス属は炭素源として酢酸を使用し、メタン生成菌と競合する可能性があります 48。乾燥と再湿潤のイベント後のプシリモナスの相対的な存在量の増加、特に空気乾燥サンプルのその後の増加は、特に後者が阻害された場合に、アセト乳酸細菌が酢酸を求めて酢酸を求めて無酢酸崩壊性メタン生成菌（この場合はメタノサルシナ）と一時的に競合した可能性を示唆しています。。

アルツハイマー病における乾燥ストレスおよび酸素ストレス下での微生物群集動態は限られた関心を集めており、ほとんどの研究は土壌や湖の堆積物などの自然環境における反応に焦点を当てており、そこではグラム陽性門（例えばファーミクテス属）がアルツハイマー病と関連して増加する全体的な傾向がみられる。グラム陰性菌門（プロテオバクテリアやバクテロイデスなど）が報告されています5,49。乾燥/干ばつストレスに対する細菌の耐性も比較的よく研究されています。耐性に影響を与える生理学的特性には、主に細胞壁の厚さと胞子形成能力が含まれます49。したがって、我々の研究において、胞子形成細菌でグラム陽性細菌であるハイドロゲニスポラとアルカリフィルス（ファーミクテス属に属する）が、バクテロイデス目（バクテロイデス目に代表され、ほとんどがグラム陰性菌）よりも全体的に高いストレス耐性を示したのは驚くべきことではない44。、50、51、52、53、54、55。しかし、これらの議論は、本研究ではプシリモナス属、シュードモナス属、ニトリンコラ属、およびブルクホルデリア科およびハロバクテロイダ科に代表されるプロテオバクテリア門の存在量の増加を説明するものではなく、これらはすべてグラム陰性かつ非芽胞形成細菌である。内胞子を生成できるハロバクテロイド科のいくつかの種を除きます46、47、56、57、58。したがって、乾燥の影響に対抗する他の細菌の戦略があるに違いありません。考えられる説明の 1 つは、これらの細菌がオスモライトを生成および蓄積し、微生物の細胞膨潤の維持と高分子構造の保護に寄与する能力である可能性があります 59。別の可能性としては、異なる微生物群間に確立されたネットワークが考えられます。つまり、微生物群集における有益な協力的相互作用により、微生物の環境ストレス耐性が潜在的に強化される可能性があります60。

乾燥-再湿潤ストレスが微生物群集における協力的相互作用に影響を与えるかどうかを評価するために、乾燥-再湿潤および培養イベント後の微生物群集について共起ネットワーク分析を実施しました。図 3 は、属レベルで少なくとも 3 つのノード (相対存在量で ≥ 0.1%) を含む古細菌と細菌で構成される微生物ネットワークにおける、次数、中間性、近さ中心性に基づいた意味相関 (p ≤ 0.001、R ≥ 0.5) を示しています。。ネットワークパターンは、乾燥-再湿潤イベントと回復/インキュベーションイベントの間で明らかに異なりました（図3aおよびb）。乾燥-再湿潤グループ(図3a)では、回収/インキュベーショングループ(図3b)よりもクラスタリングがわずかに少なく、全体的に低いR値が発生しました。アエギリバクテリア門に属する未分類の属とメタリネア属は互いに明確に関連しており、両方のネットワークにおいて比較的高い中心性を示しました（図3、表S3およびS4）。ただし、これらの分類群はサンプル中に相対的に少ない状態で存在しました (図 2)。乾燥および再湿潤処理したサンプル（図3a）では、アエギリバクテリアはBacteriodes vadinHA17およびAnaerolineaceaeを介してCandidatus Methanofastidiosum属とも正の相関があり、さらにCandidatus MethanomethylicusおよびMethanosaetaを含むメタン生成菌のサブクラスターと相関しました。ただし、メタノサルシナとは負の相関がありました。興味深いことに、Methanosarcina と他の 2 つのメタン生成菌の間の競合関係は存在せず、2 つの細菌属 Hydrogenisspora と Alkaliphilus の間の正の相互作用に置き換えられ、特に培養段階後に増加しました (図 3b)。

属レベルまたは最も近い分類レベルでの微生物プロファイルのアンプリコン配列バリアント (ASV) リードの相対存在量の相関に基づく共起ネットワーク分析。 (a) 乾燥-再湿潤後、および (b) インキュベーションイベント後。細菌および古細菌のグループは、それぞれ緑色とオレンジ色のノードで示されます。各エッジはノードのペア間の有意な相関 (p ≤ 0.001) を表し、正の相関は緑、負の相関は赤でそれぞれ色付けされます。エッジの厚さは相関の R 値に比例します (R ≥ 0.5)。

一般に、ネットワーク分析は、乾燥-再湿潤イベント後の微生物間の相互作用のネットワークが全体的に弱まっていることを示唆しましたが、一方で、増加した細菌ハイドロゲニスポラおよびアルカリフィルスとメタン生成菌のサブクラスターの間の培養イベント後に、新たな正の相関関係が確認されました。ハイドロゲニスポラとアルカリフィルスは両方とも、定期的な乾燥と再湿害にさらされる別の環境である水田でも発見されています 61,62。ハイドロゲニスポラとアルカリフィラスは両方とも発酵細菌として同定されており、酢酸塩だけでなく水素（ハイドロゲニスポラ）やギ酸塩（アルカリフィルス）も生成する44,45ため、我々の観察は、それらの相対存在量の増加は、ギ酸依存性両方の菌にとって新たな基質供給者として機能する可能性があることを示唆している。、水素栄養性および酢酸栄養性メタン生成菌。アエギリバクテリアとメタリネアの相関関係は、硫化物含有量の高い嫌気性消化槽でのそれらの同時発生を報告した最近の研究を除いて、まだ調査されていません63。さらに、エギリバクテリアとメタノリネアは、乾燥-再湿潤グループと回復グループの両方で比較的高い中心性、親密さ、つながりを示しましたが、それらの間の関係は孵化段階後に大幅に減少しました（表S4）。これは、それらがメタン生成におけるキーストーン種として機能する可能性を示唆していますBerry と Wider22 によると機能回復。

メタン生成菌に対する O2/オキシダントの重度の毒性に関する現在確立されている知識とは対照的に、私たちの観察は、O2 の存在下および非存在下での乾燥/湿潤後のメタン生成菌群集構造とメタン生成回復が予想外に類似していることを示しました。また、乾燥が嫌気性微生物群集の O2/酸化剤に対する抵抗戦略を確立するのを促進するかどうかも明らかではありません。したがって、今後の研究では、これらの条件下でメタン生成菌内で調節される遺伝子を注意深く調べて、O2/オキシダントまたは乾燥ストレス下でのメタン生成菌の自己防御機構をさらに明らかにする必要があります。私たちの研究は、メタン生成によって明らかになったように、DOC 含有量や微生物群集の組成を含む AD スラッジの元の特性が、乾燥耐性と再湿潤耐性を決定する重要な要素であると思われることを示しました。乾燥と再湿潤の後にメタン生成量が繰り返し回復するということは、微生物が新たな代謝相互作用ネットワークを形成し、よりストレス耐性の高い群集を形成する可能性があることを示唆しています。

現在の研究で得られた生の DNA 配列データは、国立バイオテクノロジー情報センターデータベース (NCBI) でアクセッション番号 PRJNA736312、BioSample: SAMN19641899 (細菌)、SAMN19643011 (Archaea) で入手できます。

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著者らは、この原稿に貴重なコメントとレビューを提供してくださった Bo H. Svensson 教授と Ralf Conrad 教授に感謝の意を表します。この研究はスウェーデンエネルギー庁 [助成金番号: 35624-2] の資金提供を受け、スウェーデンのリンシェーピング大学が主催するバイオガス研究センター内で実施されました。

リンシェーピング大学が提供するオープンアクセス資金。

これらの著者、Tong Liu と Xiaoxiao Li も同様に貢献しました。

分子科学部門、ウプサラバイオセンター、スウェーデン農業科学大学、750 07、ウプサラ、スウェーデン

トン・リウ & アンナ・シュニュラー

臨床検査医学部門、上海中医薬大学普陀病院、上海、200062、中華人民共和国

シャオシャオ・リー

テーマ研究学部 - 環境変化、リンシェーピング大学、581 83、リンシェーピング、スウェーデン

シャオシャオ・リー、セパール・シャケリ・イェクタ、アニカ・ビョルン、アレックス・エンリッチ＝プラスト

国家重点バイオリアクター工学研究所および応用化学研究所、華東科学技術大学、上海、200237、中華人民共和国

Xiaoxiao Li & Bo-Zhong Mu

環境分析用マルチユーザーユニット、リオデジャネイロ連邦大学 – UFRJ、Av. Carlos Chagas Filho、373、Bloco A、Ilha do Fundão、リオデジャネイロ、RJ、CEP 21941-971、ブラジル

Laura Shizue Moriga Masuda & Alex Enrich-Prast

バイオガス研究センター、リンシェーピング大学、581 83、リンシェーピング、スウェーデン

トン・リュー、シャオシャオ・リー、セパール・シェイカー・イェクタ、アニカ・ビョルン、アンナ・シュニュラー、アレックス・エンリッチ＝プラスト

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概念化、AP および BM。方法論、TL および AS (微生物学)、XL、LM、および AP (嫌気培養および乾燥再湿潤処理)。検証、TL および AP。正式な分析、TL および XL。調査、TLおよびXL。リソース、AS および AP。データキュレーション、TL および XL。執筆—原案の作成、AP（要約と序文）、TL（微生物学、方法、結果と考察）、XL（方法、嫌気培養および乾燥再湿潤処理）。執筆 - レビューと編集、TL、XL、SY、AB、AS、AP。視覚化、TL および XL。 AS（微生物学）およびAP（嫌気培養および乾燥再湿潤処理）の監督。プロジェクト管理、AP、AB、AS。資金調達、AP、AB、AS。すべての著者は原稿の出版版を読み、同意しました。

Tong Liu または Alex Enrich-Prast への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Liu、T.、Li、X.、Yekta、SS 他。乾燥および再湿潤イベント中の微生物の構造およびメタン生成に対する酸素の影響がない。 Sci Rep 12、16570 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-20448-5

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受信日: 2022 年 7 月 11 日

受理日: 2022 年 9 月 13 日

公開日: 2022 年 10 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20448-5

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